一、標準操作規(guī)程的確認以及人員培訓
標準操作規(guī)程(SOP)是指導操作人員進行某項操作的書面程序，是操作人員的操作標準，是生產(chǎn)操作成功的關(guān)鍵。標準操作規(guī)程應能對操作人員提供足夠的指導以完成本項操作。
標準操作規(guī)程應由技術(shù)人員編寫，部門主管審閱，質(zhì)量保證部主管批準。將批準后的標準操作規(guī)程對操作人員進行培訓，使之真正理解并能熟練掌握。標準操作規(guī)程的原件及培訓記錄存放在資料管理部門，操作現(xiàn)場存放的是復印件。驗證前應確認每一項操作有標準可依，以免造成管理上的漏洞，且確認這項操作已被培訓過，同時操作人員已能熟練掌握。
驗證之前應對所有的操作人員和質(zhì)量管理人員培訓與驗證有關(guān)的各項操作(可根據(jù)驗證方案和SOP)，以避免驗證過程中有關(guān)人員不理解甚至不知道怎么做，保證驗證的順利實施。如果生產(chǎn)車間新增加或調(diào)換的無菌操作人員超過20%，應重新做無菌工藝驗證，以保證無菌操作能順利進行。
二、儀表校正
儀表校正應由有資格的人員或單位按照公司批準過的SOP來進行，并符合國家可追蹤的標準。儀表的校正頻率至少符合國家規(guī)定，并根據(jù)使用頻率調(diào)整并嚴于此標準。使用頻率越高，儀表的磨損越厲害，校正頻率就應越高。由于使用沒有經(jīng)過校正的儀表，所得的數(shù)據(jù)無效。
三、工藝條件
無菌原料藥的生產(chǎn)工藝具有其自己的特點：設備種類多、設備復雜、管路長，且不同的生產(chǎn)工藝有不同的特：點，根據(jù)各自的特點選擇固體或液體模擬介質(zhì)。雖然，已盡量地減少設備的內(nèi)部暴露和減少物料產(chǎn)品的暴露，但是不可避免地會有一些設備與外界環(huán)境相通，或是物料暴露在環(huán)境中，這些開口處應有呼吸器或百級層流空氣的保護，更好的是使用隔離器保護。驗證時，應有模擬這些物料暴露的操作。
有些生產(chǎn)工藝中具有結(jié)晶的操作，這使得模擬過程有些困難，因為結(jié)晶過程中有相變產(chǎn)生，應該考慮這種變化是否會影響到微生物的生長。最好的辦法是選擇兩種模擬介質(zhì)，它們在結(jié)晶過程發(fā)生反應生成另一種模擬介質(zhì)。選擇這樣的介質(zhì)可能會有很大困難，簡單起見，也可用同一種液體模擬介質(zhì)模擬結(jié)晶過程流經(jīng)所有管路加到結(jié)晶罐中。若結(jié)晶過程有加晶種的操作，模擬過程中也應有這樣的操作。晶種可用模擬介質(zhì)代替。為使晶體粒度均勻，有些結(jié)晶過程有降溫過程，在模擬過程中不應降溫，因為微生物在低溫下不易生長。
干燥過程中的溫度一般 會抑制微生物生長，甚至將微生物殺死，在模擬過程中應保持室溫，以免溫度太高殺死細菌而使驗證失敗。也有用冷凍干燥除去濕分的，模擬凍干參數(shù)的選擇也不應使細菌的生長受到抑制。
總之，在驗證過程中盡量使工藝參數(shù)和實際情況一致，但是為了使微生物生長良好，允許選擇的工藝參數(shù)和實際情況不一致，?但是這些參數(shù)不應和生產(chǎn)工藝產(chǎn)生重大差別。無菌原料藥的分裝劑量一般較大，在這種情況下分裝過程中應減慢分裝速度，以增加產(chǎn)品暴露的可能，在最差狀況進行操作。
在進行驗證時，應根據(jù)生產(chǎn)過程中曾經(jīng)出現(xiàn)的異常情況或者可以預想的可能的異常情況設置最差條件，以考察生產(chǎn)過程中出現(xiàn)此異常情況時產(chǎn)品的無菌性質(zhì)是否會受到影響。
四、操作時限
在原料藥的生產(chǎn)中，每一操作都應有操作時限來保證已滅菌的物品避免受到微生物的污染或產(chǎn)品降解。操作時限越長，產(chǎn)品受污染的幾率越大。
在無菌工藝驗證時，應將操作時限調(diào)整至最大，在最差狀況下操作如果這時驗證結(jié)果可靠，那么在小于此時間下進行的操作當然也是可靠的。尤其是已滅菌物品由滅菌到使用時的保存時間更加重要。在驗證時，應將已滅菌物品至少放置到規(guī)定的保存時間，這樣的驗證結(jié)果更具說服力。每一步操作都應延長甚至超過操作時限，這樣會使得總的工藝時間很長，但是這樣的驗證結(jié)果更能保證正常生產(chǎn)時的無菌狀態(tài)。
五、環(huán)境監(jiān)測
在驗證過程中環(huán)境的質(zhì)量至關(guān)重要，應在惡劣的環(huán)境下進行操作，但是不能惡劣到使產(chǎn)品發(fā)生染菌的程度。一般采用增加操作人員數(shù)量的辦法惡化環(huán)境。應對環(huán)境進行監(jiān)測以評價驗證過程，所有暴露產(chǎn)品的操作都應同時監(jiān)測本區(qū)域的環(huán)境。環(huán)境監(jiān)測包括以下幾個項目：無菌室的溫度、濕度、塵埃粒子、沉降菌、浮游菌、人員和表面微生物。
沉降菌和浮游菌用培養(yǎng)皿進行測試，培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂或其他適宜的培養(yǎng)基。培養(yǎng)皿應放置在微生物監(jiān)測史上情況最差的部位。在驗證過程中應增加取樣的頻率，并且應在分裝區(qū)域放有2個以上的取樣培養(yǎng)皿連續(xù)暴露取樣，暴露時間應為分裝的全過程，但不宜超過4h，否則營養(yǎng)瓊脂變干而不能提供足夠的營養(yǎng)使細菌不能長出。若工藝時間超出4h，應重新放置一個新的培養(yǎng)皿進行監(jiān)測。營養(yǎng)瓊脂在使用前應做微生物生長促進試驗，以保證營養(yǎng)瓊脂對微生物生長的適應性。
方法如下：選擇合適數(shù)量的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(此數(shù)量具有統(tǒng)計學意義)，分別接種10~100 CFU的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲得和環(huán)境中的檢出菌。細菌分別置于(32.5±2.5)℃的環(huán)境中培養(yǎng)不超過3天，真菌置于(22.5±2.5)℃的環(huán)境中，分別培養(yǎng)不超過5天。接種的微生物生長良好。測試浮游菌可以用縫隙一瓊脂撞擊采樣法、離心采樣法、液體撞擊采樣法及膜過濾法。一般說來，浮游菌比沉降菌更能反映環(huán)境的質(zhì)量。表面微生物的測試可用擦拭法或Rodac碟。擦拭法用于非規(guī)則表面的微生物測試，用擦拭法測表面微生物之前應先測回收率。影響回收率的因素很多，包括微生物的種類和數(shù)量，不同的操作人員進行測試會得到不同的回收率，主要原因是擦拭時用力的大小，每個測試操作人員有自己的回收率數(shù)值。測試回收率時，不要選擇生命脆弱的微生物，因為這些微生物被擦拭時會死去，產(chǎn)生不可信的結(jié)果。用Rodac碟測試規(guī)則表面的微生物污染程度比較方便，但是這種測試會有營養(yǎng)物質(zhì)殘留在被測試的表面，應清洗干凈，否則這是一個很大的污染。塵埃粒子盡可能使用在線監(jiān)測，取樣點數(shù)和取樣量符合現(xiàn)行的法規(guī)的要求，監(jiān)測的結(jié)果應能證明在產(chǎn)品暴露的關(guān)鍵區(qū)域空氣質(zhì)量達到了100級潔凈區(qū)的空氣質(zhì)量標準。
六、工藝過程的模擬和全培養(yǎng)
由于一般原料藥生產(chǎn)工藝都經(jīng)過結(jié)晶過程，其間會發(fā)生相變，因此無菌工藝驗證不可能完全按照原來的實際工藝來進行模擬。
從原材料配制起，以培養(yǎng)基作為模擬介質(zhì)，經(jīng)過除菌過濾、結(jié)晶、過濾、洗滌幾個步驟后，為了保證所用的介質(zhì)是全部用于無菌檢驗，需要對多余的模擬介質(zhì)采取措施進行全量培養(yǎng)，以保證所用介質(zhì)的完整性。以后的干燥、粉碎、分裝步驟再按生產(chǎn)工藝進行。為了考察各步驟的無菌狀況，要在各個階段進行取樣，模擬生產(chǎn)過程中的取樣，不要刻意地增加取樣點。取樣的樣品也要進行培養(yǎng)，以達到全面培養(yǎng)的目的。為了保證取樣的無菌性，對取樣口進行滅菌，如果不能使用蒸汽滅菌，可以使用殺孢劑滅菌，但在取樣前要保證殺孢子劑殘留沒有抑菌性。
生產(chǎn)過程中可能有升溫、降溫過程，此時應注意模擬介質(zhì)對溫度的敏感性?？赏ㄟ^實驗室考察。
七、樣品培養(yǎng)
陰性對照：在驗證過程中，隨機取出有代表性的一定數(shù)量的裝有培養(yǎng)基的包裝容器作為陰性對照。陽性對照：驗證過程中，隨機取出有代表性的一定數(shù)量的裝有模擬介質(zhì)的包裝容器，1/3接種濃度為<100 CFU的5種標準菌株和環(huán)境的檢出菌，接種后細菌在(32.5±2.5) ℃環(huán)境下培養(yǎng)48~72 h，霉菌和酵母菌在225±2.5)℃培養(yǎng)5天，接種包裝容器中均有明顯的所接種微生物的生長，以此作為陽性對照。
樣品培養(yǎng)：將分裝得到的產(chǎn)品在操作現(xiàn)場灌裝培養(yǎng)基，然后密封，檢查密封性。全部產(chǎn)品應在(22.5±2.5)℃和(32.5±2.5)℃分別培養(yǎng)7天，總培養(yǎng)14天，每天檢查全部樣品的微生物生長情況。若發(fā)現(xiàn)污染應注明批號、包裝容器號，同時檢查密封情況。若有破損注明原因。污染的樣品應做微生物鑒別，鑒別到種。
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